Голографическая интерферометрия и лазерная микроскопия эритроцитов

В уравнении /1/ величина ∆n(x, y) принимается за постоянную, так как показатель преломления внутри клетки постоянен. Это объясняется тем, что эритроцит по всему объему равномерно заполнен гемоглобином. Таким образом, в уравнении /1/ величина ∆У (x, y) измеряемая по интерферограмме клетки, связана прямой зависимостью с толщиной клетки T (x, y). Рассчитав значение толщины эритроцита вдоль его диаметра, можно построить поперечное сечение клетки /Рис. 1, Б/. Исходя из осевой симметрии эритроцитов, зная его сечение, рассчитывается площадь поверхности и объем эритроцитов. Более простой способ измерения состоит в расчёте этих параметров по микрофототрафиям эритроцитов, помещенных в аутоплазму, где клетки собраны в упорядоченные группы типа "монетных столбиков" .

Построение поперечного сечения эритроцитов позволяет проводить количественную оценку формы клетки. Для этого, при описании сечения эритроцита нами были введены коэффициенты: основные a(DC), b (BD), c (ED), d (AE) численные значения которых определялись по данным интерферометрии (Рис. 2) и производные: Кϕ = (b – d)/ c – коэффициент, описывающий степень прогиба центральной части клетки. Кэл.= b/a ,описывает периферическую часть’ клетки и с/R ( R радиус) показывает относительное расстояние от центра эритроцита до точки, где толщина клетки максимальна. Эти коэффициенты были использованы в дальнейшем для оценки изменений формы эритроцитов в норме и патологии (Рис. 5).

Рис. 2. Иллюстрация к определению основных ‘параметров формы эритроцитов (пояснение в тексте)

Величины для концентрации гемоглобина и его ‘массы в эритроцитах были получены для эритроцитов, переведенных в сферическую форму. Величина ∆n связана с объемной концентрацией внутриклеточных веществ (гемоглобина)– Cv ( Feleppa ‚ 1972) . Отсюда для концентрации гемоглобина имеем: Cv = ∆n/α, где α – характеристический коэффициент, определяемый оптическими свойствами вещества.

Масса гемоглобина m, определяется как произведение концентрации гемоглобина на, объем эритроцита. Для клеток сферической формы получаются простые выражения для Сv и m

Cv = 1,344 (∆Y max/S R) (2)

m = 5,63 ∆Ymax./S (3)

Где ∆Y max – максимальное отклонение интерференционной полосы, проходящей через центр эритроцита, S – расстояние между полосами вне клетки, R – радиус эритроцита.

Наблюдение эритроцитов в проходящем и отраженном пользованием лазерного освещения, с использованием микрокиносъемки и видеозаписи , позволило получить новые данные о процессах, преобразования формы эритроцитов от диска к сфере. Интерферограммы эритроцитов, полученные при их исследовании в отраженном свете, позволили наблюдать активное движение внутри эритроцитов в переходной стадии преобразования формы клетки (Рис. 6).

Проделанные в работе расчёты разрешающей способности лазерной микроскопии, оценка чувствительности голографической интерферометрии, определение погрешностей измерений, параметров формы и массы эритроцитов, показали, что предложенные методики оценки со стояния живых, нефиксированных эритроцитов расширяют возможности традиционных методов цитологического анализа и могут быть успешно использованы для количественных и качественных исследований эритроцитов и других типов клеток.

2. Сравнительная характеристика свойств эритроцитов по данным голографической интерферометрии и’ лазерной микроскопии в норме и патологии

В этой серии исследований эритроциты в аутоплазме сохраняли нормальную форму до конца эксперимента. Нами наблюдалось наличие неоднородности в распределении эритроцитов в зависимости от диаметра. Во всех обследованных группах детей /здоровых, больных диффузным гломерулонефритом, сахарным диабетом, наследственным сфероцитозом /НС/ наблюдалось полимодальное распределение эритроцитов.

Средние значения отдельных мод не зависели от вида патологии. Было выделено 5 средних модовых значений диаметров эритроцитов: 6,75 мкм, 7,45 мкм, 8,20 мкм, 8,80 мкм, 9,40 мкм. Процентное распределение эритроцитов по этим группам показало, что в норме 51,5% клеток относятся к группе со средним диаметром 8,20 мкм. При сахарном диабете зв этой группе находится 16,0% клеток, и 63,04 со средним диаметром 8,80 мкм. При гломерулонефрите менее выражено наличие центрального пика (38,5% со средним диаметром 8,20 мкм, 32,5% 8,80 мкм). При наследственном микросфероцитозе 35,0% эритроцитов имеют средний диаметр 8,20 мкм, и значительное число клеток малого диаметра (37,5# 7,45 мкм, 27,24 6,75 мкм). В отдельных случаях вместо полимодального распределения эритроцитов наблюдались две достоверно различающиеся группы (Р <0,05).

Сравнение эритроцитов по размерам: диаметр, толщина, площадь поверхности, объем, коэффициент сферичности, по параметрам формы Кϕ, К эл. С/R , по массе и концентрации гемоглобина в клетках не выявило значительных различий между группами здоровых детей и детей больных диффузным гломерулонефритом и сахарным диабетом. Популяции эритроцитов периферической крови здоровых детей и детей больных НС достоверно различались по всем параметрам (Р‹0,05) . (Таблица 1.) кроме объема, коэффициента С/R, массы (30,9 ± 1.1 пг, 29,1± 0,8 пг) и концентрации гемоглобина в клетках (36,6± 1,45%, 38,2± 1,46%).

Эритроциты, помещенные в аутоплазму, как в норме, так и при НС наблюдались в виде дисков, собранных в "монетные столбики". Истинные сфероциты при НС полностью отсутствовали, хотя они присутствовали в сухом мазке, как клетки уменьшенного диаметра. Средняя величина объема эритроцитов при НС практически совпадает со средней величиной объема эритроцитов в норме, а площадь поверхности снижена. Уменьшение площади поверхности эритроцитов при неизменном объеме приводит к разбуханию клеток при НС, что характеризуется сниженной величиной коэффициента сферичности: отношение площади поверхности к объему равно 1,22, в норме 1,65. Снижение коэффициента сферичности за счет уменьшения площади поверхности приводит к снижению осмотической резистентности эритроцитов при НС.

Рис. 3. Иллюстрация связи осмотической резистентности эритроцитов с коэффициентом сферичности. Пояснение в тексте.

Кривые осмотического гемолиза: Nг – число погибших эритроцитов в %, С NaCl концентрация хлористого натрия.

Распределение эритроцитов Nэ в % в зависимости от их коэффициента сферичности (S/V). Сплошная линия – норма, точечная – НС. Сдвиг кривой распределения эритроцитов в сторону меньших значений отношения S/V соответствует сдвигу кривой осмотической резистентности эритроцитов в сторону больших концентраций NaCl, что указывает на снижение осмотической резистентности при НС.

Кроме измерения средних величин методы голографической интерферометрии и лазерной микроскопии позволяют исследовать отдельные эритроциты одновременно по нескольким параметрам. Это позволяет выявлять характер соотношений между различными количественными характеристиками эритроцитов внутри популяции. Исследования показали наличие общих свойств эритроцитов в норме и при наследственном микросфероцитозе. Так, зависимость площади поверхности эритроцитов от их диаметров имеет общий вид в обоих случаях (Рис. 4).