Тема 1. Введение в микробиологию
1. Предмет и задачи микробиологии
Микроорганизмы – наиболее древняя и самая распространенная форма организации жизни на Земле, что свидетельствует об их значительной роли в природе и жизни человека. Ученые подсчитали, что в биосфере обитает не менее 1030 бактерий, а число вирусов и простейших вообще не поддается учету. Эти мельчайшие существа могут быть как растительного, так и животного происхождения. К ним относят бактерии, вирусы, грибы, простейшие и микроводоросли. Общей характерной особенностью этих микроорганизмов является их микроскопический размер. Но все они имеют особенное происхождение, определенное строение и формы жизнедеятельности, при этом они всегда находятся в биоценотическом (от греч. bios – «жизнь» и coinos – «общий») отношении с другими живыми существами и неживой природой. При этом они состоят из структур, которые обеспечивают их жизненные процессы, направленные на выживание и размножение.
Микроорганизмы обусловливают круговорот веществ и энергии в природе, осуществляют расщепление органических веществ и синтез белка, обеспечивают плодородие почв и поддерживают газовый состав атмосферы и других природных процессов. Большое значение микроорганизмы играют в производственных процессах, связанных с получением необходимых для человека продуктов и материалов (например, хлебопечении, производстве органических кислот, ферментов, пищевых белков, гормонов, антибиотиков и других лекарственных веществ), а также в виноделии. Из вышеизложенного можно сделать вывод, что микроорганизмы играют важную роль в природе и жизни человека.
Изучение свойств «маленьких зверьков», как назвал микроорганизмы А. Левенгук, позволило выделить среди них безвредные и даже полезные для организма человека и оказывающие неблагоприятное влияние на человеческий организм. Первые – непатогенные, или сапрофиты, питаются органическими веществами от отмерших организмов. Они населяют кожу и слизистые оболочки, желудочно-кишечный и урогенитальный тракты, таким образом составляя экологическое единство с организмом человека и поддерживая постоянство некоторых процессов его жизнедеятельности. Вторые – патогенные – живут и питаются за счет органических субстратов, вызывают у человека различные заболевания и патологические процессы. При снижении сопротивляемости организма сапрофиты могут вызывать болезни и в этом случае ведут себя как патогенные микроорганизмы, и их называют условно-патогенными.
Микроорганизмы изучает наука микробиология.
Микробиология – наука, предметом изучения которой являются микроскопические существа, невидимые вооруженным взглядом и называемые микроорганизмами, их биологические признаки, систематика, экология, взаимоотношения с другими организмами.
Как самостоятельная наука микробиология сформировалась только во второй половине XIX в., и этому поспособствовал ряд гениальных открытий великого французского ученого Луи Пастера (роль микробов в круговороте веществ в природе, в процессах гниения и брожения и т. д.), хотя микроорганизмы были открыты уже в конце XVII в. Наличие в природе невидимых существ предполагали уже очень давно. Так, еще в VI в. до н. э. Гиппократ высказывал предположение о том, что причиной любой заразной болезни является невидимый человеческому глазу организм. Но в то время свое предположение он не мог доказать по естественным причинам. Зато это смог подтвердить А. Левенгук, который, смастерив первый в мире простейший микроскоп, обнаружил мельчайшие организмы в дождевой воде, зубном налете и других материалах и описал их.
С того времени микробиология шагнула далеко вперед, так как для изучения микроорганизмов перед ней открылись широкие возможности использования методов и технологий других наук, например физики и биологии, биоорганической химии, генетики, цитологии, иммунологии и молекулярной биологии. При этом перед микробиологией увеличилось и количество задач, которые не могут быть решены в пределах одной научной дисциплины и специалистами одного профиля. В связи с этим произошла дифференциация микробиологии на самостоятельные научные дисциплины. Теперь микробиология подразделяется на общую и частную. При этом общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Частная микробиология изучает отдельных представителей микромира в зависимости от их проявлений и влияний на окружающую среду. Частными разделами микробиологии являются медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская и космическая микробиология.
Медицинская микробиология занимается изучением патогенных для человека микроорганизмов и в зависимости от их природы делится на бактериологию, вирусологию, микологию и протозоологию. При этом каждая дисциплина проводит микроскопические и другие виды исследований, а также изучает физиологические и генетические особенности патогенных микроорганизмов; роль микроорганизмов в этиологии и патогенезе инфекционных болезней; основные клинические проявления и распространенность вызываемых ими заболеваний; специфическую диагностику, профилактику и лечение заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами; экологию патогенных микроорганизмов.
Медицинская микробиология подразделяется на санитарную, клиническую и фармацевтическую микробиологию.
Предметом изучения санитарной микробиологии являются санитарно-микробиологическое состояние объектов окружающей среды и пищевых продуктов, разработка санитарных нормативов.
Предметами изучения клинической микробиологии являются определение роли условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, а также диагностика и способы профилактики этих болезней.
Предметом изучения фармацевтической микробиологии являются инфекционные болезни лекарственных растений и их порча под действием микроорганизмов; обсеменение лекарственных средств в процессе их изготовления и уже готовых лекарственных форм; методы асептики, антисептики, дезинфекции при производстве лекарственных средств; технология получения микробиологических и иммунологических диагностических, профилактических и лечебных препаратов.
Ветеринарная микробиология изучает возбудителей заболеваний животных, разрабатывает методы их биологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения, направленного на уничтожение микробов-возбудителей в организме больного животного.
Сельскохозяйственная микробиология занимается изучением микроорганизмов, которые участвуют в круговороте веществ, используются для приготовления удобрений, вызывают заболевания растений и др.
Основной задачей технической микробиологии является разработка биотехнологии синтеза микроорганизмами биологически активных веществ: белков, ферментов, витаминов, спиртов, органических веществ, антибиотиков и др.
Морская микробиология изучает микрофлору морей и водоемов.
Космическая микробиология изучает микрофлору космического пространства и других планет; влияние космических условий на свойства микроорганизмов и микрофлору организма человека. Эта дисциплина также разрабатывает методы предупреждения заноса микробов с поверхности Земли в космос и ряд других проблем.
Многочисленные открытия в микробиологии, изучение свойств и взаимоотношений между макро– и микроорганизмами способствовали развитию иммунологии. Эта наука доказала, что иммунная система организма служит для его защиты не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных ему веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды в нем. Поэтому на основе достижений в иммунологии стали разрабатываться лабораторные методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также иммунологические препараты, к которым относятся вакцины, иммуноглобулины, аллергены, диагностические препараты и др.
Таким образом, современная микробиология играет важную роль в диагностике, профилактике и лечении инфекционных и неинфекционных болезней.
2. Систематика и номенклатура микроорганизмов
В процессе изучения микроорганизмы были систематизированы по сходству и различиям, а также по взаимоотношениям между собой. Наука, изучающая принципы классификации, называется таксономией, что в переводе с греческого означает «расположение, порядок». Таксоном называют группу организмов, объединенных по определенным однородным свойствам в рамках той или иной таксономической категории. Такими категориями являются: царство – самая крупная токсономическая категория; далее следуют: подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и другие более мелкие категории.
Таксономия микроорганизмов основана на их морфологических, физиологических, биохимических и молекулярно-биологических свойствах.
Согласно современной систематике все микроорганизмы относятся к трем царствам: Vira – вирусы; Eucaryotae – простейшие и грибы; Procaryotae – преимущественно одноклеточные микроорганизмы.
Прокариоты отличаются от эукариотов тем, что не имеют морфологически оформленного ядра, сетчатого аппарата Гольджи, эндоплазматической сети, митохондрий, их рибосомы имеют константу седиментации 70S.
Для названия микроорганизмов в микробиологии была принята бинарная номенклатура, включающая родовое и видовое название. Название рода основывается на морфологическом признаке соответствующего микроорганизма или является производной от фамилии открывшего или изучившего данный микроорганизм. Видовое название связано с наименованием основного вызываемого этим микроорганизмом заболевания или основным местом обитания. При этом если видовую принадлежность микроорганизма установить не удается (чаще при идентификации микроорганизмов с нетрадиционными условиями существования и пищевыми потребностями), но определена принадлежность к роду, то употребляется термин «species».
Царство прокариотов состоит из двух отделов: цианобактерии (Cyanobacteria) – непатогенные микроорганизмы, обитающие во внешней среде (их медицинская микробиология не изучает); бактерии (Bacteria) – различные микробы, обитающие во внешней среде, а также в организме человека и животных, при этом медицинская микробиология изучает среди них патогенные микробы.
В свою очередь отделы подразделяются на порядки: собственно бактерии; актиномицеты; спирохеты; риккетсии; хламидии; микоплазмы.
Поскольку бактерии, являясь преимущественно одноклеточными микроорганизмами, способны образовывать ассоциации, или группы, сходных клеток, характеризующиеся клеточными, но не организменными свойствами, то порядки подразделяют на группы. Всего их 19, причем первые четыре из них являются непатогенными для организма человека:
1) фототрофные бактерии;
2) скользящие бактерии;
3) бактерии, образующие слизистую оболочку;
4) почкующиеся и (или) стебельковые бактерии;
5) спирохеты;
6) спиралевидные и изогнутые бактерии;
7) грамотрицательные аэробные палочки и кокки;
8) грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки;
9) грамотрицательные анаэробные бактерии;
10) грамотрицательные кокки и коккобациллы;
11) грамотрицательные анаэробные кокки;
12) грамотрицательные хемолитотрофные бактерии;
13) метанобразующие бактерии;
14) грамположительные кокки;
15) палочки и кокки, образующие эндоспоры;
16) грамположительные аспорогенные палочковидные бактерии;
17) актиномицеты и родственные организмы;
18) риккетсии;
19) микоплазмы.
Чтобы отнести выделенный штамм бактерий к какой-либо группе, следует определить морфологию микробных клеток; отношение к окраске по Грамму; тип биологического окисления; способность к спорообразованию.
На основании изучения биохимических свойств бактерий происходит дальнейшая дифференциация групп на семейства, роды и виды.
Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид.
Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками.
Таким образом, для видовой идентификации бактерий необходимо знать следующие их свойства:
1) морфологические (форму и структуру бактериальной клетки);
2) тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями);
3) культуральные (характер роста на питательной среде);
4) биохимические (способность утилизировать различные субстраты);
5) антигенные.
Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Так, выделенная из определенного источника и имеющая отличные от других представителей данного вида признаки чистая культура микроорганизмов называется штаммом. Это понятие является более узким, чем вид или подвид, а близким к нему является понятие клона, который представляет собой совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.
В зависимости от характера наследственных свойств среди микроорганизмов различают:
1) серовары (по антигенной структуре);
2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам);
3) фаговары (по чувствительности к фагам);
4) ферментовары;
5) бактериоциновары;
6) бактериоциногеновары.
Бактериоцины – вещества, продуцируемые бактериями и губительно действующие на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактерициногеновары.
В настоящее время для систематики микроорганизмов используется ряд таксономических систем.
1. Нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Для ее применения необходимо иметь информацию о многих десятках признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков.
2. Серотаксономия. Изучает антигены бактерий с помощью реакций с иммунными сыворотками. Наиболее часто применяется в медицинской бактериологии. Недостаток – бактерии не всегда содержат видоспецифический антиген.
3. Хемотаксономия. Применяются физико-химические методы, с помощью которых исследуется липидный, аминокислотный состав микробной клетки и ее определенных компонентов.
4. Генная систематика. Основана на способности бактерий с гомологичными ДНК к трансформации, трансдукции и конъюгации, на анализе внехромосомных факторов наследственности – плазмид, транспозонов, фагов.
Совокупность основных биологических свойств бактерий можно определить только у чистой культуры – это бактерии одного вида, выращенные на питательной среде.
3. Питательные среды и методы выделения чистых культур
Для культивирования бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований.
1. Питательность. Среды должны быть легкоусвояемыми и обязательно содержать углерод, азот, кислород и водород в виде минеральных или органических соединений, неорганические соединения различных солей и факторы роста.
2. Изотоничность. Для поддержания осмотического давления среды должны содержать определенную концентрацию хлорида натрия.
3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.
4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.
5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).
6. Стерильность (чтобы не было других бактерий).
Поскольку бактерии обладают различными свойствами, то для их выращивания и изучения требуется достаточно большое количество питательных сред, которые бы имели различное происхождение, состав, консистенцию и назначение. Поэтому была введена классификация питательных сред.
Классификация питательных сред
I. По происхождению:
1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);
2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);
3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов и т. д.).
II. По составу:
1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон, агар и бульон Хоттингера и др.;
2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточные агар и бульон, желточно-солевой агар, среда Китта-Тароцци, среда Вильсона-Блера и др.
III. По консистенции:
1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);
2) полужидкие (0,15–0,7 % агар-агара);
3) жидкие (не содержат агар-агара).
IV. По назначению:
1) общего назначения – универсальные – предназначены для культивирования большинства бактерий, так как содержат питательные вещества, в присутствии которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар). Тем не менее из-за большого разнообразия бактерий и их питательных потребностей создать такую универсальную питательную среду, чтобы она была пригодна для культивирования любых бактерий, практически невозможно;
2) специального назначения применяются для выращивания бактерий, не способных размножаться на универсальных средах:
а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется. Например, в щелочной пептонной воде и щелочном мясопептонном бульоне интенсивнее по сравнению с другими сопутствующими бактериями растет холерный вибрион. Показателен и пример избирательности питательных сред, содержащих определенные концентрации антибиотиков: на них развиваются только штаммы, обладающие устойчивостью к ним, антибиотикочувствительные культуры в этих средах погибают;
б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среды Эндо, Левина, Плоскирева и др.). Кроме того, к дифференциально-диагностическим средам относят и специальные среды, позволяющие определить способность бактерий утилизировать тот или иной субстрат (среды Гиса с углеводами и мясопептонный желатин служат для определения протеолитической активности микроорганизмов; среда Симмонса – для определения способности бактерий разлагать цитрат; среда Хью-Лейфсона используется для дифференцирования аэробных бактерий от факультативно-анаэробных и др.);
в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон).
Для получения чистой культуры необходимо владеть методами выделения чистых культур.
Методы выделения чистых культур
Выделяют следующие методы.
1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твердой питательной среды шпателем, метод Дригальского).
2. Использование элективных питательных сред.
3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды обогащения).
Чистую культуру получают в виде колоний – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде, представляющее собой, как правило, потомство одной клетки. Разные виды бактерий образуют колонии, которые одна от другой отличаются по форме, величине, прозрачности, характеру поверхности, высоте, цвету, консистенции.
Тема 2. Морфология и ультраструктура бактерий
1. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции
Отличия бактерий от других клеток
Выделяют следующие отличия:
1) бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра;
2) в клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан – муреин;
3) в бактериальной клетке отсутствуют аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, митохондрии;
4) роль митохондрий выполняют мезосомы – инвагинации цитоплазматической мембраны;
5) в бактериальной клетке много рибосом;
6) у бактерий могут быть специальные органеллы движения – жгутики;
7) размеры бактерий колеблются от 0,3–0,5 до 5–10 мкм.
По форме клеток бактерии подразделяются на:
1) шаровидные (кокковые) формы. Кокки имеют правильную сферическую форму или форму неправильного шара в виде почки или напоминают пламя свечи. В среднем кокки в диаметре составляют 0,5–1,5 мкм. В зависимости от взаиморасположения клеток относительно друг друга кокки делятся на микрококки с отдельным изолированным расположением; диплококки – сцепленные попарно; тетракокки – сцепленные по четыре; стрептококки – сцепленные в цепочку; сарцины – сцепленные по 8, 12, 16 и т. д.; стафилококки – сцепленные беспорядочно, внешним вводом напоминая виноградную гроздь;
2) палочковидные (или цилиндрические) формы бактерий. Длина палочки составляет 1–8 мкм, а размер в поперечнике – 0,5–2 мкм. Бактерии различаются по форме и бывают правильной и неправильной, изогнутой, цилиндрической формы; по размерам – мелкие, средние и крупные, причем длина может значительно превышать диаметр поперечника; по форме концов – обрубленные, закругленные, заостренные, утолщенные. Так же как и шаровидные бактерии, палочковидные делятся и по характеру взаиморасположения и бывают расположенными поодиночке, диплобактерии и диплобациллы, сцепленные попарно, а также стрептобактерии и стрептобациллы, сцепленные в цепочку;
3) извитые формы бактерий различаются по характеру и количеству завитков. Среди них различают вибрионы в виде изогнутых палочек или неполных завитков; спириллы с одним или несколькими завитками; спирохеты, которые делятся на лептоспиры – завитки с загнутыми крючкообразными концами (S-образная форма), боррелии – 4–12 неправильных завитков, трепонемы – 14–17 равномерных мелких завитков.
Стоит отметить, что размеры бактерий, так же как и их форма (хотя и реже), могут изменяться, и это происходит под влиянием окружающей среды, в том числе питательной среды, ее рН, температуры, лекарственного препарата и т. п., а также в зависимости от возраста культуры. При этом подобные изменения не наследуются и являются лишь модификациями.
Ультраструктура бактерий изучается с помощью электронно-микроскопических исследований, дифференциального ультрацентрифугирования и цитохимических методов.
В бактериальной клетке различают:
1) обязательные органеллы:
а) нуклеоид – ядерное вещество, распыленное в цитоплазме клетки. Не имеет ядерной мембраны, ядрышек. В нем локализуется ДНК, представленная двухцепочечной спиралью. Обычно замкнута в кольцо и прикреплена к цитоплазматической мембране. Содержит около 60 млн пар оснований. Это чистая ДНК, она не содержит белков гистонов. Их защитную функцию выполняют метилированные азотистые основания. В нуклеоиде закодирована основная генетическая информация, т. е. геном клетки. Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы ДНК с меньшей молекулярной массой – плазмиды. В них также закодирована наследственная информация, но она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки;
б) цитоплазму, которая представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (75 %), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений;
в) рибосомы, которые представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц – 30 S и 50 S. Рибосомы отвечают за синтез белка. Перед началом синтеза белка происходит объединение этих субъединиц в одну – 70 S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть;
г) цитоплазматическую мембрану, которая представляет собой сложный липидобелковый комплекс, располагающийся непосредственно под клеточной стенкой и ограничивающий протопласт клетки. Этот комплекс состоит из липидов (15–30 %), белков (50–70 %), углеводов (2–5 %) и РНК. В цитоплазматической мембране локализуются пермеазы и ферменты окислительного фосфорилирования и регулируется транспорт метаболитов и ионов; происходит выделение ферментов и токсинов; мембрана принимает участие в репликации ДНК нуклеотида и его делении; участвует в синтезе компонентов клеточной стенки, а у некоторых бактерий – и в спорообразовании.
Производными цитоплазматической мембраны клетки являются мезосомы, образующиеся путем ее инвагинации в цитоплазму. Они могут быть в виде концентрических мембран, пузырьков, трубочек, в форме петли. Мезосомы связаны с нуклеоидом и участвуют в делении клетки и спорообразовании;
д) клеточную стенку, которая представляет собой биогетерополимер – плотную структуру, окружающую протопласт клетки и придающую ей постоянную форму;
2) необязательные органеллы:
а) споры;
б) капсулы;
в) ворсинки (реснички, фимбрии);
г) жгутики.
Включения являются продуктами метаболизма микроорганизмов, которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ. К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др.