Руководство к практическим занятиям по биохимии. Учебное пособие для студентов специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза»

Утверждено РИС Учёного совета Медицинского института Российского университета дружбы народов

Авторский коллектив:

Т. А. Лобаева, Е. В. Неборак, И. П. Смирнова

Рецензенты:

Смирнова Ксения Валерьевна – к.б.н., зав. лабораторией вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России

Шатова Ольга Петровна – к.м.н., доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии РНИМУ им. Н.И. Пирогова

Предисловие

В предлагаемом читателю Руководстве авторы попытались подвести некоторые итоги опыту постановки и проведения лабораторно-практических занятий на кафедре биохимии имени академика Т. Т. Берёзова МИ РУДН для студентов 2 курса специальностей «Ветеринария» и «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

Основной задачей занятий по биохимии по специальности «Ветеринария» на втором курсе является обучение студента чёткой формулировке цели исследования, овладению методическими приёмами исследования, проведению самого опыта. В перечень проводимых работ дополнительно включены демонстрационные работы, которые помогут студентам лучше овладеть знаниями курса биохимии, а также календарные планы практических и лекционных занятий.

Перед выполнением каждой лабораторной работы дано краткое изложение теоретических положений, подробно приводится описание хода работ в виде удобных таблиц, позволяющих легко оформить полученный результат. В конце каждого раздела имеются контрольные вопросы, целью которых является выработка у будущего специалиста самостоятельного осмысления связи между полученными данными эксперимента и установившимися теоретическими положениями.

Предлагаемые работы полностью соответствуют программе дисциплины «Биохимия» для специальности «Ветеринария» и составлены в соответствии с лекционным курсом, читаемым на кафедре биохимии им. акад. Березова Т. Т. МИ РУДН.

В указатель литературы внесены лишь названия книг, методических пособий, которые использовались ранее при составлении Руководства для выполнения практических работ на кафедре биохимии. Авторы не сочли целесообразным в настоящем Руководстве давать ссылки на оригинальные статьи, используемые в описании работ. Дополнения, как правило, вносились в связи с поставленными в опыте задачами и обозначались знаком в виде *.

Все указания и критические замечания будут приняты авторами с глубокой признательностью.

Общие правила техники безопасности в биохимической лаборатории

Важное правило для студентов:

Если вы испытываете какие-либо сомнения в методике эксперимента или в технике безопасности, прежде чем продолжить работу, проконсультируйтесь с Вашим преподавателем.

1. Приступая к выполнению практической работы, необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией или методикой.

2. Работать в учебной биохимической лаборатории следует только в отведённое для этого время под контролем преподавателя.

3. Все манипуляции с химическими реактивами, посудой и приборами должны проводиться в спецодежде (медицинский халат, при необходимости – перчатки).

4. Во время выполнения работы следует соблюдать порядок и чистоту.

5. Следует избегать вдыхания паров или газов; никакие вещества в лаборатории нельзя пробовать на вкус, запрещается пить, принимать пищу, курить.

6. Нельзя нагревать, смешивать и взбалтывайте реактивы вблизи лица. Отверстие химического сосуда следует направлять в сторону, противоположную от лица и тела. Нельзя засасывать жидкость в пипетку ртом, необходимо пользоваться специальным приспособлением для наполнения пипеток.

7. Необходимо соблюдать особую осторожность при работе с сильными кислотами или щелочами, особенно при нагревании. Нельзя добавлять воду к концентрированным кислотам или щелочам.

8. Категорически запрещается уже отмеренные реактивы сливать (высыпать) обратно в сосуды, из которых их отмеряли.

9. Запрещается выливать в раковины концентрированные растворы щелочей и кислот, органические растворители, легковоспламеняющиеся, горючие вещества, щелочные металлы. Все указанные отходы должны обязательно собираться в специальные ёмкости.

10. Недопустимо оставлять во включенном состоянии без присмотра газовую горелку и электрические приборы.

11. О любых ситуациях, способных нанести вред здоровью, необходимо немедленно информировать преподавателя.

Список сокращений и условных обозначений

АДФ – аденозинтрифосфат

АМК – аминокислота

АМФ – аденозинмонофосфат

цАМФ – циклический АМФ

АТФ – аденозинтрифосфат

АТФаза – аденозинтрифосфата

ВЖК – высшая жирная кислота

ГАФ – глицеральдегид-3-фосфат

ГДФ – гуанозиндифосфат

ГМФ – гуанозинмонофосфат

ГТФ – гуанозинтрифосфат

ДАГ – диацилглицеролы

ДАФ – диоксиацетонфосфат

α-КГ – α-кетоглутаровая кислота

КоА – кофермент (коэнзим) А

КоQ – кофермент (коэнзим) Q

КФ – классификация ферментов

ЛП – липопротеины

ЛПВП – липопротеины высокой плотности

ЛПНП – липопротеины низкой плотности

ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

МАГ – моноацилглицеролы

МАО – моноаминооксидаза

НАД⁺ – никотинамидадениндинуклеотид окисленный

НАДН(Н⁺) – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НАДФ⁺ – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный

НАДФН(Н⁺) – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный

ПВК – пировиноградная кислота

ПФ – пиридоксальфосфат

СДГ – сукцинатдегидрогеназа

ТАГ – триацилглицеролы

ТХУ – трихлоруксусная кислота

УДФ – уридиндифосфат

УМФ – уридинмонофосфат

УТФ – уридинтрифосфат

ФАД – флавинадениндинуклеотид окисленный

ФАДН_{2 –} флавинадениндинуклеотид восстановленный

ФЕП – фосфоенолпируват

ФМН – флавинаденинмононуклеотид

Фн – неорганический фосфат

ФФн – неорганический пирофосфат

ФФК – фосфофруктокиназа

ФЭК – фотоэлектроколориметр

ХЭ – холинэстераза

ЦТК – цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)

ЩУК – щавелевоуксусная кислота

D – оптическая плотность

Dоп – оптическая плотность опытного

образца

Dст – оптическая плотность стандартного образца

Dк – оптическая плотность контрольного образца

К_М – константа Михаэлиса

V_max – максимальная скорость реакции

Календарный план проведения лекций и практических занятий по биохимии

для студентов 2 курса по специальности «Ветеринария» и «Ветсанэкспертиза» (1 ч. лекции, 2 ч. – практические занятия)

Лекции

1 неделя. Основные классы биологических соединений. Уровни структурной организации белка. Связь структуры белков с их биологическими функциями. Простые и сложные белки.

3 неделя. Ферменты. Строение ферментов. Природа активного центра. Аллостерическая регуляция. Изоферменты. Свойства ферментов, специфичность действия. Ингибиторы ферментов. Роль коферментов в реакциях обмена веществ. Применение ферментов.

5 неделя. Гормоны. Классификация гормонов. Механизмы действия гормонов. Примеры гормональной регуляции обмена веществ.

7 неделя. Введение в обмен веществ и энергии. Обмен углеводов. Распад и синтез гликогена в печени и мышцах. Анаэробный распад углеводов: гликолиз и гликогенолиз. Энергетический эффект. Глюконеогенез.

9 неделя. Аэробный обмен углеводов. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты. Цикл Кребса, его энергетический эффект. Понятие о пентозофосфатном пути превращения углеводов. Регуляция углеводного обмена.

11 неделя. Обмен липидов. Классификация липидов. Значение микрофлоры рубца в переваривании липидов. Превращение глицерина и его роль. β-окисление жирных кислот. Энергетический эффект распада пальмитиновой кислоты.

13 неделя. Особенности распада жирных кислот у жвачных животных. Роль ацетил-КоА в обмене липидов. Биосинтез жирных кислот. Метаболизм кетоновых тел. «Кетозы». Роль холестерина в обмене веществ. Обмен белков. Биологическая и кормовая ценность белков.

15 неделя. Обмен простых белков. Влияние недостаточности аминокислот и белка на развитие животных. Пути превращения аминокислот. Превращения аминокислот в кишечнике, в тканях. Декарбоксилирование аминокислот. Дезаминирование аминокислот. Пути обезвреживания аммиака. Орнитиновый цикл мочевинообразования.

17 неделя. Обмен сложных белков. Обмен нуклеопротеинов. Распад и биосинтез пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов. Особенности обмена белка у птиц. Обмен хромопротеинов. Взаимосвязь обмена белков, липидов и углеводов.

Практические занятия

РАЗДЕЛ 1. ПРОСТЫЕ И СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ. НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ

1 неделя. Вводная беседа. Семинар по теме: «Химия белков, аминокислоты».

2 неделя. Лабораторная работа «Цветные реакции на белки и аминокислоты». Лабораторные работы «Диализ белков», «Хроматография аминокислот». Семинар «Простые и сложные белки». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

3 неделя. Семинар «Нуклеиновые кислоты. Структура ДНК и РНК и их биологическая роль», «Витамины». Лабораторная работа «Количественное определение витамина С в картофеле». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

4 неделя. Семинар по теме «Ферменты, коферменты, витамины». Лабораторная работа «Действия амилазы на крахмал». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

5 неделя. Коллоквиум 1 «Аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты. Ферменты и витамины». Контрольная работа.

РАЗДЕЛ 2. ГОРМОНЫ. ОБМЕН УГЛЕВОДОВ

6 неделя. Семинар «Гормоны». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

7 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Регуляция обмена углеводов». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Лабораторная работа «Определение продукта ферментативного расщепления крахмала».

8 неделя. Семинар «Обмен углеводов. Пентозофосфатный путь». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

9 неделя Семинар «Биологическое окисление». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

10 неделя. Коллоквиум по Модулю 2 «Гормоны. Обмен углеводов». Контрольная работа.

РАЗДЕЛ 3. ОБМЕН ЛИПИДОВ. ОБМЕН ПРОСТЫХ БЕЛКОВ

11 неделя. Семинар «Обмен липидов. Регуляция липидного обмена». Лабораторная работа «Кинетика действия свиной липазы». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

12 неделя. Семинар «Обмен липидов: распад и синтез высших жирных кислот. Расчет энергетического эффекта распада высших жирных кислот». Лабораторная работа «Определение некоторых веществ в образцах мочи человека». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

13 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: переваривание, всасывание, пути превращения». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос). Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

14 неделя. Семинар «Обмен белков и аминокислот: токсичность и нейтрализация аммиака в организме». Лабораторная работа «Количественное определение белка биуретовым методом. Построение калибровочных кривых». Проверка домашней подготовки к занятию (устный опрос).

15 неделя. Семинар по теме: «Обмен белков». Контрольная работа.

16 неделя. Коллоквиум по Модулю 3 «Обмен липидов. Обмен простых белков».

17 неделя. Итоговое занятие.

Правила пользования приборами для биохимических исследований

1. ФОТОМЕТР

В биохимических исследованиях фотометр используется для определения концентрации вещества в растворе по оптической плотности или коэффициенту пропускания раствора. Действие фотометра основано на том, что многие химические соединения поглощают свет в определенной спектральной области. При этом в определенных пределах концентраций величина оптической плотности раствора (то есть интенсивность поглощения света) прямо зависит от концентрации вещества в растворе. Оптическая плотность раствора определяется по формуле:

D = E l • c

D – оптическая плотность

E – коэффициент молярной экстинкции

l – толщина кюветы

c – концентрация раствора

E – коэффициент молярной экстинкции (или молярный коэффициент поглощения) – это оптическая плотность раствора концентрацией 1 моль/л при длине светового пути (толщине кюветы) равной 1 см. Величина постоянная для каждого вещества при данной длине волны.

Фотометр КФК-3–01. Общий вид

1 – ручка изменения длины волны излучения

2 – световое табло

3 – панель управления

4 – крышка кюветного отделения

5 – ручка перемещения кювет

6 – тумблер «Сеть»

Показания светового табло

7 – выбор режима измерения оптической плотности

8 – градуировка

9 – результаты измерения оптической плотности холостой пробы (воды)

10 – результаты измерения оптической плотности исследуемого раствора

11 – кювета (внешний вид)

Правила работы с прибором

1. Включите прибор в сеть. При закрытой крышке кюветного отделения включите тумблер «Сеть» (6), расположенный на боковой поверхности прибора. Тумблер загорится красным светом. В нижней половине светового табло (2) сначала появится надпись «Прогрев прибора», затем надпись «Прогрев лампы». По истечении 10 мин фотометр выдаст звуковой сигнал и на табло появится надпись «Готов к работе. Введите режим».

2. Последовательным нажатием клавиши D на панели управления (3) выберите нужный режим измерения (А – оптическая плотность), который высветится в нижней части светового табло (7).

3. Установите нужную длину волны круглой ручкой (1), находящейся слева на передней панели прибора (значение длины волны высвечивается в верхней строке светового табло). Установку длины волны необходимо выполнять подводкой со стороны коротких волн к более длинным. Если при установке значение длины волны превысило требуемое, необходимо вновь вернуться на 20–30 нм к более коротким волнам и повторно аккуратно подвести к требуемому значению длины волны.

4. Промойте водой кюветы (11) и промокните их внутреннюю поверхность чистой фильтровальной бумагой. Снаружи также протрите их фильтровальной бумагой. Откройте крышку кюветного отделения (4). Налейте в кювету воду и установите ее строго вертикально в дальнее гнездо кюветодержателя. Исследуемый раствор налейте во вторую кювету и установите ее в ближнее гнездо кюветодержателя. При установке кювет нельзя касаться их рабочих поверхностей. Наличие загрязнений на рабочих поверхностях может привести к неверным результатам.

5. Ручку перемещения кювет (5) установите в крайнее левое положение.

6. Закройте крышку кюветного отделения.

7. Нажмите клавишу «#» на панели управления. В нижней части светового табло на верхней строке появится надпись «Градуировка» (8), а через 3–5 секунд надпись «Измерение». На нижней строке появится измеренное значение оптической плотности холостой пробы (воды), например «А = 0,000» (9). Оно должно составлять 0,000±0,002. Если значение А имеет большее отклонение от нуля, необходимо повторно провести градуировку (нажать «#»).

8. Ручку перемещения кювет установите вправо до упора. Через несколько секунд на нижней строке появится значение оптической плотности исследуемого раствора, например «А = 0,230» (10). Запишите полученное значение оптической плотности в рабочую тетрадь.

9. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.

2. ТЕРМОБЛОК

Термоблок предназначен для нагревания проб в пробирках и виалах в заданном температурном режиме.

ВАЖНО: прибор работает без заполнения ячеек водой. Заполнение водой опасно для жизни!

Термоблок ПЭ-4020. Общий вид.

1 – тумблер «Сеть»

2 – кнопка «Установка/работа»

3 – кнопки установки температуры

4 – ячейки для пробирок

5 – световое табло

6 – световой индикатор работы

Правила работы с прибором

1. Включите тумблер «Сеть» (1). Тумблер загорится красным светом.

2. Используя кнопки установки температуры (3) выставите на световом табло (5) требуемый температурный режим.

3. Нажмите кнопку «Установка/работа» (2). После этого начнется нагрев ячеек. Световой индикатор работы (6) станет мигать красно-зеленым цветом, а на световом табло высветится текущая температура в ячейках, которая будет постепенно увеличиваться, пока не достигнет заданного значения. После этого термоблок будет работать в режиме поддержания заданной температуры.

4. После достижения заданной температуры установите пробирки с исследуемыми растворами в ячейки термоблока (4) и оставьте их в течение необходимого срока инкубации.

5. После завершения работы выключите прибор нажатием тумблера «Сеть» и отключите прибор из сети.